Mitkä tekijät vaikuttavat mEGFP:n stabiilisuuteen?
Turun ammattikorkakoulun Kemiantekniikan Uudet materiaalit ja prosessit -tutkimusryhmässä hyödynnetään itse tuotettua vihreää fluoresoivaa proteiinia (mEGFP) mallimolekyylinä biomateriaalien annosteluteknologiatutkimuksessa. Tutkimuksessa on havaittu proteiinin olevan epästabiili korkeissa pitoisuuksissa. Epästabiilisuus ilmenee proteiinipitoisuuden muutoksina ja mittaustuloksien eroina. Näiden perusteella tulee pohtia, mitkä asiat vaikuttavat mEGFP:n stabiilisuuteen ja miten niiden vaikutuksia voitaisiin jatkossa minimoida.
Mikä mEGFP?
mEGFP on monomeerinen vihreää fluoresoiva proteiini, jota luonnossa esiintyy Aequorea victoria-meduusoissa. Nimensä mukaan proteiini säteilee vihreää valoa altistuessaan UV- tai sinivalolle. mEGFP:tä voidaan tuottaa yhdistelmä-DNA-tekniikalla muokatussa E. coli -bakteerissa laboratorio-olosuhteissa ja sitä voidaan käyttää merkkiaineena sekä mallimolekyylinä erilaisissa bioalan tutkimuksissa. Proteiinin etuna on sensitiivisyys sekä bioyhteensopivuus ja se on helppo havaita fluoresenssimittauksen avulla.
mEGFP:n käsittelytavat, jotka vaikuttavat stabiilisuuteen: Vanhat ja uudet tavat
Aikaisemmin tutkimusryhmässä käytössä oleessa mEGFP:n puhdistusmenetelmässä kromatografia-ajon tuloksena saadulle proteiiniliuokselle tehtiin puskurinvaihto konsentraattorilla, josta konsentroitu mEGFP-liuos pipetoitiin talteen. Käytetty konsentraattori täytettiin puskurilla ja siirrettiin jääkaappiin säilytykseen seuraavaa kertaa varten. Tämän jälkeen konsentroidulle mEGFP:lle suoritettiin mittaukset kahden eri analyysimenetelmän avulla, joilla saatiin mEGFP:n proteiinipitoisuus sekä fluoresenssiarvo. Proteiinipitoisuuden mittaukseen käytettiin jauheesta tai ampulli-liuoksesta valmistettuja proteiinistandardeja ja tulosten laskemiseen standardikuvaajasta lineaarista sovitetta.
Opinnäytetyössä kehitetyssä menetelmässä konsentrointu mEGFP pipetoidaan talteen, mutta ennen konsentraattorin siirtoa säilytykseen, sille suoritetaan yksi puhdistuskonsentrointi, jonka avulla konsentrointiputkeen jäänyttä näytettä saadaan enemmän talteen. Lisäksi käytettäville analyysimenetelmille löytyi keinoja, joilla niistä saatiin luotettavampia tuloksia. Ensimmäiseksi mittauksia suorittaessa tulee huomioida mEGFP:n viskoottisuuden vaikutus tuloksiin, sillä mitä viskoottisempaa näyte on, sitä haastavampia pipetoinnit ovat. Toisena tulee huomioida käytettävät laimennuskertoimet, koska suurempien laimennuskertoimien huomattiin aiheuttavan isompia eroja mittauskertojen välisissä tuloksissa. Tämän seurauksena mahdollisimman pieniä laimennuskertoimia suositellaan käytettäväksi mittauksissa. Lisäksi proteiinipitoisuutta mitattaessa tulisi käyttää kaupallista proteiiniliuosta standardien valmistukseen ja sovitteena toisen asteen polynomifunktiota suoran sijaan.
mEGFP:n stabiilisuuteen vaikuttaa edellä mainittujen lisäksi näytteiden jäädytys-sulatukset, joissa näyte sulatetaan ja jäädytetään uudelleen. Näiden vaikutusta testattiin eri proteiinipitoisuuksille. Testien perusteella todettiin korkeampien proteiinipitoisuuksien olevan epästabiilimpia verrattuna matalampiin proteiinipitoisuuksiin. Tulosten perusteella kaupallisesti myyty 1 mg/ml-pitoisuus todettiin stabiilimmaksi. Tutkimusryhmässä on kuitenkin tarve 5-8 mg/ml pitoisuudelle, joka todettiin tutkimuksessa lähes yhtä stabiiliksi.
Uudet tavat, miksi parempia?
Puhdistuskonsentroinnin lisäyksen seurauksena mEGFP:tä saadaan enemmän talteen verrattuna aikaisempaan tapaan. Proteiinipitoisuuden mittauksiin kannattaisi käyttää uutta tapaa, jossa käytetään ampulli-liuoksesta valmistettuja standardeja sekä toisen asteen sovitetta, koska näiden avulla saataisiin luotettavampia tuloksia. Ylipäätään analyysimenetelmien käytössä tulee huomioida mEGFP:n näytteen viskoottisuus sekä käytettävät laimennuskertoimet, koska näiden todettiin vaikuttavan mittaustuloksiin. Matalammilla proteiinipitoisuuksilla ja pienemmillä laimennuskertoimilla saatiin tasaisempia tuloksia, mikä vahvistui myös jäädytys-sulatusten tuloksissa. Toteutettujen mittausten perusteella 5-8 mg/ml pitoisuus on toimiva tutkimusryhmälle, koska tällöin mittauksiin ei jouduttaisi käyttämään suuria laimennuskertoimia sekä säilytystilavuudet eivät olisi niin suuria verrattuna pitoisuuteen 1 mg/ml.
Yhteenveto
Uusien tapojen avulla saataisiin tuotettua stabiilimpaa mEGFP:tä, koska niiden avulla minimoitaisiin siihen vaikuttavia häiriötekijöitä. Alla on listattuna tapoja, joilla voitaisiin parantaa mEGFP:n stabiilisuutta.
- Puhdistuskonsentroinnin käyttö puskurinvaihdossa
- Proteiinipitoisuuden mittauksiin ampullista valmistetutut standardit ja toisen asteen polynomifunktio
- Laimennoksia tehdessä laimennuskertoimien ja viskoottisuuden huomiointi
- Proteiinipitoisuus säilytyksessä 1-8 mg/ml
Lähteet:
Ristolainen, S. 2023. mEGFP:n stabiilisuuden määritys – Theseus, Turun ammattikorkeakoulun opinnäytetyö.