Analyysimenetelmän kehitys UPLC-laitteella
Ultrakorkean erotuskyvyn nestekromatografia (UPLC) on lääke-, ympäristö- ja biokemiallisissa analyyseissä paljon käytetty tekniikka. UPLC-menetelmän kehittäminen on systemaattinen prosessi, jonka aikana optimoidaan menetelmän olosuhteet ja laitteiston parametrit toistettavien ja oikeiden tulosten aikaansaamiseksi. Asianmukaisella menetelmäkehityksellä varmistetaan analyyttien tunnistaminen ja kvantitointi.
UPLC on edistyneempi versio vuosikymmeniä käytössä olleesta korkean erotuskyvyn nestekromatografiasta (HPLC). UPLC-laitteisto kestää edeltäjäänsä isompaa painetta ja pystyy tämän vuoksi hyödyntämään alle 2 µm partikkeleita stationäärifaasissa. Näiden ansioista UPLC-tekniikalla on mahdollista saavuttaa parempi resoluutio eli erotuskyky ja alhaisempi detektointiraja kuin mitä HPLC:llä olisi mahdollista. Lisäksi analyysiajat ovat UPLC:tä käytettäessä lyhyempiä. Tehokkaan UPLC-menetelmän kehittäminen on tärkeää tarkkojen ja toistettavien tulosten varmistamiseksi.
Liikkuvan faasin valinta
Liikkuvan faasin valinta on ratkaiseva tekijä UPLC-menetelmän kehittämisessä. Se vaikuttaa analyyttien erotukseen ja piikkien muotoihin. Käänteisfaasikromatografiassa käytetään liikkuvassa faasissa tavallisesti veden ja orgaanisen liuottimien, kuten asetonitriilin, metanolin tai tetrahydrofuraanin, seosta. Lisäksi liikkuvan faasin pH säädetään tarvittaessa.
Kolonnin valinta
Kolonni valitaan analysoitavien analyyttien kemiallisten luonteiden ja tarvitun erotuskyvyn perusteella. Kolonnin ominaisuudet, kuten pituus, halkaisija, partikkelikoko ja pakkausmateriaali, vaikuttavat sen erotustehokkuuteen, vuorovaikutukseen kuluvaan aikaan, sekä laitteiston paineeseen. Yleisimpiin käytettyihin kolonneihin kuuluvat käänteisfaasikromatografiassa käytetyt C18- ja C8-kolonnit, joissa silikan hydroksyyliryhmistä osa on korvattu hiilivetyketjuilla.
Isokraattinen vai gradientti
Isokraattisessa ajossa liikkuvan faasin koostumus pysyy samana koko ajon ajan. Gradienttiajoissa puolestaan liikkuvan faasin koostumus muuttuu ajon aikana. Valinta isokraattisen ja gradienttiajon välillä tehdään analysoitavien näytteiden ominaisuuksien ja menetelmältä vaaditun erotustehokkuuden perusteella. Gradienttiajo on välttämätön, jos esim. ajoajasta on tulossa isokraattisella ajolla liian pitkä esim. tutkittavien analyyttien kemiallisen erilaisuuden vuoksi.
Virtausnopeus ja lämpötila
Virtausnopeus ja lämpötila vaikuttavat merkittävästi UPLC:n suorituskykyyn. Suuri virtausnopeus lyhentää analyysiin kuluvaa aikaa, mutta saattaa heikentää menetelmän resoluutiota. Lämpötilan optimoinnilla voidaan parantaa analyytin liukoisuutta ja piikkien muotoa. Näiden parametrien optimoiminen on olennaista halutun erotustehokkuuden ja -nopeuden saavuttamiseksi.
Detektorit
UPLC-laitteistoon voidaan yhdistää erilaisia detektoreita, kuten UV-Vis-, fluoresenssi- tai massaspektrometri (MS). Detektorin valinta riippuu analyyttien ominaisuuksista ja vaaditusta herkkyydestä. UV-Vis-detektori on yleisesti käytetty ja se soveltuu yhdisteille, joissa on kromofori. Massaspektrometri on hyvin selektiivinen ja sillä voidaan detektoida pienempiä pitoisuuksia kuin UV-Vis-detektorilla. Jos analysoitava näyte on leimattu radioaktiivisella aineella, detektoriksi tulisi valita radiodetektori, jolla voidaan havaita säteilyn määrää.
Menetelmän validointi
UPLC-menetelmän kehityksen jälkeen on tärkeää validoida menetelmä. Validoinnilla vahvistetaan menetelmän soveltuvuus sen aiottuun käyttötarkoitukseen. Tärkeimpiä validointiparametreja ovat tarkkuus, toistettavuus, spesifisyys, lineaarisuus sekä detektointi- ja kvantitointirajat. Niiden avulla osoitetaan analyysimenetelmän kyky tuottaa toistuvasti oikeita tuloksia.
Lähteet:
Patrakka, H. 2024. UPLC-menetelmän kehitys : CYP17A1-entsyymin reaktiotuotteiden määritys – Theseus, Turun ammattikorkeakoulun opinnäytetyö.
Dong, M. & Huynh-Ba, K. 2020. Validation of Stability-Indicating HPLC Methods for Pharmaceuticals: Overview, Methodologies, and Case Studies. LCGC North America Vol. 38, 11, 606-618. https://www.chromatographyonline.com/view/validation-of-stability-indicating-hplc-methods-for-pharmaceuticals-overview-methodologies-and-case-studies
Kuva: Heini Patrakka