• biologinen aktiivisuus
• kylmäkuivaus
• mallimolekyyli
• mEGFP
• merkkiaine

mEGFP eli monomeerinen vihreää fluoresoiva proteiini on lääkekehityksessä yleisesti käytetty mallimolekyyli, jonka avulla pystytään seuraamaan ilmiöitä elävässä solussa tai eläimessä. Kylmäkuivauksessa saadaan nestettä sisältävä, jäädytetty tuote kuivaksi sublimaation avulla. Käsittelyssä tuotteen jää muuttuu suoraan kaasuksi. Kylmäkuivausmenetelmää käytetään yleisesti elintarvike- ja lääketeollisuudessa. Menetelmän avulla voidaan kuivata esimerkiksi hedelmiä ja marjoja. Lääketeollisuudessa kylmäkuivausta käytetään rokotteiden ja lääketablettien valmistuksessa sekä proteiinien säilömiseen. Monien proteiinien, kuten myös mEGFP-liuoksen, aktiivisuus on usein epävakaata säilytyksessä. Kuiva, kiinteä olomuoto saa proteiinin stabiilimpaan ja paremmin säilyvään tilaan, mikä voidaan saada aikaiseksi kylmäkuivaamisella.

Kylmäkuivaaminen

Kylmäkuivaus säilöntämenetelmänä voi olla monesta syystä hyvä vaihtoehto. Kylmäkuivauksen avulla tuotteesta voidaan saada:

• pidempään säilyvä
• kemiallisesti ja fysikaalisesti vakaa
• helpommin kuljetettava
• helposti nesteeseen uudelleenliuotettava.

Kylmäkuivaus kuivaa tuotteen poistamalla jäädytetystä tuotteesta vettä sublimaation avulla suoraan jäästä kaasuksi. Sublimaatio tapahtuu, kun olosuhteet ovat oikeanlaiset. Lämpötilan ja paineen tulee olla veden kolmoispisteen alapuolella. Veden kolmoispiste on lämpötilan ja paineen tila, jossa veden kaikki kolme olomuotoa, neste, kiinteä ja kaasu, ovat tasapainossa. Kylmäkuivaus voidaan jakaa kolmeen vaiheeseen: jäädytykseen, primaarikuivaukseen ja sekundaari kuivaukseen. Jäädytyksessä kuivattava tuote jäädytetään ja primaari- ja sekundaarikuivauksessa tuote kuivuu sublimaation avulla.

Kylmäkuivauksessa voidaan käyttää tarvittaessa erilaisia apuaineita parantamaan tai suojaamaan tuotteen ominaisuuksia. Apuaine tarkoittaa jotakin muuta ainetta kuin sitä, joka halutaan kylmäkuivata. Apuaine nimensä mukaisesti auttaa tuotetta esimerkiksi:

• säilymään
• suojaamaan kylmäkuivauksen aiheuttamilta fyysisiltä stressitekijöiltä
• parantamaan kemiallista tai fyysistä stabiiliutta
• parantamaan rakennetta
• helpottamaan säilömis- tai kuljetusmahdollisuuksia sekä uudelleenliuotusta.

Apuaineita on monia erilaisia, joista yleisimpiä ovat sokerit, aminohapot, alkoholit, proteiinit ja erilaiset puskurit.

mEGFP

mEGFP tarkoittaa monomeerista vihreää fluoresoivaa proteiinia, joka hohtaa vihreänä sinivalossa. Proteiini on alun perin eristetty luonnossa esiintyvästä Aequorea Victoria -meduusasta ja siitä on laboratorioissa tehty useita muunnoksia, joista yksi on mEGFP. Tätä proteiinia voidaan tuottaa Escherichia coli –bakteerisoluissa liittämällä proteiinia tuottava geeni osaksi solun DNA:ta. Bakteerisoluja kasvatettaessa, solut tuottavat kohdeproteiinia sisäänsä. Tuottoproteiini saadaan vapautettua hajottamalla bakteerisolut. mEGFP-proteiinia käytetään monesti bio- tai lääke alojen laboratorioissa malliproteiinina, koska se on helposti nähtävissä ja mitattavissa, eikä se ole myrkyllinen tai häiritse biologisia prosesseja.

Proteiinien kylmäkuivaaminen ja menetelmäkehitys mEGFP-proteiinille

Proteiinit ovat monesti nestemäisessä muodossa fysikaalisesti ja kemiallisesti epästabiileja, koska ne ovat herkkiä ympäristössä tapahtuville muutoksille. Kuiva ja kiinteä muoto saa proteiinit vakaampaan tilaan, mikä saadaan aikaiseksi kylmäkuivaamisella. Monet proteiinit tarvitsevat kylmäkuivauksesta selvitäkseen suojaavia, stabiloivia ja rakennetta parantavia apuaineita. Nämä auttavat proteiinia säilyttämään täyden biologisen aktiivisuuden.

Opinnäytetyössä tutkittiin ja kehitettiin mEGFP-proteiinille kylmäkuivausmenetelmä. Kehitystä aloittaessa tiedossa ei vielä ollut, miten tämä proteiini selviää kylmäkuivauksesta tai minkä tyyppisiä apuaineita se mahdollisesti voisi tarvita. Tämän vuoksi kuivauksissa selvitettiin, miten eri tekijät vaikuttavat kuivaukseen. Tekijöitä oli:

• proteiinin pitoisuus
• kuivattavan näytteen määrä
• apuaineet ja niiden pitoisuudet
• jäädytyslämpötila
• kylmäkuivausohjelman kesto, lämpötila ja paine.

Opinnäytetyön tuloksena kehitettiin toimiva kylmäkuivausmenetelmä mEGFP:lle. Selvisi, että proteiinia voi kylmäkuivata ilman apuaineita 1–5 mg/ml:n proteiinipitoisuuksissa.

Lähteet:

Kaurala, J. 2023. mEGFP:n kylmäkuivausmenetelmän kehittäminen – Theseus, Turun ammattikorkeakoulun opinnäytetyö.