• Harha
• Koesuunnitelma
• Muuttuja
• optimointi
• Proteiinituotto

Opinäytetyössä tehdyn proteiinituoton optimoinnin tarkoituksena oli kasvattaa tuotantoa ja vähentää kustannuksia. Optimoinnin lähestymistavaksi valittiin yksimuuttujatesti, jota voidaan hyödyntää, kun tavoitteena on saada mahdollisimman suuri tai kenties mahdollisimman pieni tulos.

Opinnäytetyössä optimoitiin meGFP-yhdistelmäproteiinin tuotto E. coli -mikrobikannassa käyttäen yksimuuttujatestejä. Proteiinia yritettiin tuottaa mahdollisimman paljon, mutta optimoinnista huolimatta tuotetun proteiinin määrä alkoi laskea optimointitestien edetessä.

Kuvassa 1 näkyy proteiinimäärää kuvaavan fluoresenssisignaalin lasku. Laskun syytä selvitettiin opinnäytetyössä, ja yksi syy saattaa olla työssä käytetty yksimuuttujatesti. Proteiinituotanto optimoitiin tutkimalla seitsemää proteiinituottoon vaikuttavaa parametriä. Indusoinnilla voidaan tarkoittaa sekä proteiinin tuotantoa että sen aloitusta. Induseri on laukaiseva tekijä, joka aloittaa tuotannon.

Opinnäytetyössä tutkitut proteiinituottoon vaikuttavat parametrit:

• Kasvatusliemi
• Indusointiajankohta
• Indusointilämpötila
• Induserin pitoisuus
• pH eli happamuus
• Sekoitusnopeus
• Indusointiaika

Opinnäytetyössä kohdatuista haasteista huolimatta, optimoinnin ansiosta onnistuttiin tuottamaan 210 grammaa kirkkaan vihreää solumassaa, 3,5 kertaa aiempaa enemmän. Se ei kuitenkaan ole todennäköisesti paras mahdollinen saanto. Tuotantoa voidaan vielä optimoida edelleen käyttämällä parempia optimointimenetelmiä ja selvittämällä syy testitulosten laskulle.

Tutkittujen parametrien lisäksi opinnäytetyön virheanalyysissä selvitetään kahdeksan tuntemattoman muuttujan vaikutusta proteiinituotantoon. Näitä muuttujia oli joko mahdotonta tai hyvin haastavaa kontrolloida.

Muuttujat, joiden vaikutusta selvitettiin virheanalyysissä:

• Solujen kunto
• Hapensaanti
• Plasmidin vuoto
• Liuosten tuoreus
• Kompleksien ravintoseoksien koostumus ja reaktiotuotteet
• pH nousu kasvatuksen aikana
• Näytteenoton aiheuttama häiriö
• Työvaiheiden nopeutuminen kokemuksen myötä
• Yksimuuttujatesti

Jokainen tuntematon muuttuja on todennäköisesti vaikuttanut joissain määrin tulosten laskuun, mutta yhdenkään muuttujan ei voitu todeta olevan varmasti merkittävä pääsyy tulosten laskulle.

Miten hallita sitä mitä ei voi nähdä? Kuvitteellinen vertauskuva

Kuvitellaan, että olet myynyt lippuja järjestämääsi esitykseen. Esityksessä huomaat, että kaikille ei riitä istumapaikkoja. Et halua menettää lipputuloja, joten seuraavaan esitykseen olet hankkinut lisää istumapaikkoja, mutta ne kaikki eivät mahdukaan katsomoon. Laajennat katsomoa, mutta nyt takarivi ei kuule esitystä tai eturivi tulee kuuroksi. Täytyy siis sijoittaa kattavampaan äänentoistojärjestelmään. Olisiko ollut järkevämpää ja taloudellisempaa vain kutsua vähemmän yleisöä kerralla ja järjestää useampi esitys?

Normaalisti kuvailtu tilanne vältetään, koska esityksen järjestäjä voi laskea istumapaikat ja laittaa saman määrän lippuja myyntiin. Myös katsomon äänentoistoa voidaan testata ennakkoon paikan päällä. Esityksen suosion kasvaessa katsomon laajennuksen kannattavuus voidaan arvioida. Katsojilta voidaan myös saada palautetta. Asia on toisin, jos järjestetty esitys on kooltaan mikroskooppinen.

Kuvailtu tilanne on tavallista proteiinituoton optimoinnissa mikrobeilla. Katsojien tilalla vain on mikroskooppisia eliöitä, istumapaikkana eliöiden ravintoliemi ja katsomona bioreaktori. Äänentoisto voi kuvastaa esimerkiksi ilmastusta, jonka kautta mikrobit saavat happea. Lipputulojen määrä kuvastaa tuotetun kohdeproteiinin määrää, molempien määrä on samoin tavoin verrannollinen viihtyvyyteen. Esitys olkoon vaikka liemen sekoitus, joka ei saa olla liian hidas ja mateleva, mutta ei myöskään liian nopea ja stressaava.

Mikroskooppinen asetelma on haasteellinen, koska tutkija ei voi tietää, kuinka monta istumapaikkaa on tarpeeksi tai minkälainen istumapaikka on mukava. Ehkä katsomo on ahdas tai istumapaikat liian lähekkäin. Voi olla että katsomo on liian suuri ja katsoja ei edes löydä itselleen paikkaa. Tutkija ei voi myöskään käydä paikan päällä testaamassa äänentoistoa tai kysyä katsojien mielipidettä. Ainoa palaute ovat lipputulot koko prosessin lopussa, eli tuotetun proteiinin määrä.

Yksi ratkaisu on järjestää monta lähes identtistä mikroesitystä yhdellä muuttujalla, ainoa ero esitysten välillä on äänenvoimakkuus. Tuottavimman mikroesityksen äänenvoimakkuus todetaan parhaaksi, se vakioidaan ja sillä jatketaan. Tehdään uusi mikroesityssarja, jossa ainoana muuttujana on katsomon tilavuus. Huomataan että tähän asti käytetty tilavuus on paras. Mikä tuuri! Seuraavaksi tutkitaan tuolien määrää, ja taas todetaan että alkuperäinen määrä on paras. Voiko olla näin hyvä tuuri? Ei.

Sitä ei tutkittu eikä siitä saatu palautetta

Ensimmäisen testin tuottavimmassa esityksessä eturivi sai tinnitusta, samalla kun takarivi ei saanut puheesta selvää. Normaalissa esityksessä tämä oltaisiin huomattu jo ennen esitystä ja istumapaikkoja oltaisiin voitu tiivistää keskemmälle katsomoa, mutta sitä ei tutkittu kyseisessä testissä, eikä siitä saatu palautetta. Mikroesityksessä äänenvoimakkuus oli sopiva suurimmalle mahdolliselle osalle katsojista, jotka maksoivat esityksestä mielellään. Etu- ja takarivin viihtyvyyttä ei voitu ottaa huomioon, koska he ovat pieni vähemmistö, jolloin kyseisessä tuoli- ja tilajärjestelyssä heidän reklamaatioilla ei ole merkittävää vaikutusta lipputuloihin.

Seuraavaksi testattiin katsomon kokoa. Normaalisti oltaisiin huomattu, että pienentämällä katsomoa ja samalla tiivistämällä istumapaikkojen väliä takariveissä kuultiin vähän paremmin, mutta yhä useampi eturiveistä sai tinnitusta, myös pienet istuinvälit kävivät ahtaiksi. Suurentamalla katsomoa ja istumapaikkojen välejä, osa eturivistä kärsi yhä tinnituksesta ja takarivissä entistä useampi ei kuullut mitään. Normaalisti oltaisiin huomattu, että nyt kannattaa tiivistää istumapaikkoja taaemmaksi ja nostaa äänenvoimakkuutta, mutta mikroesityksen äänenvoimakkuus oli jo tutkittu ja vakioitu.

Viimeisessä testissä tuolien määrän vähentäminen suoraan vähensi katsojien ja siten myös lipputulojen määrää. Tinnituksesta ja huonosta äänentoistosta kärsivien määrä saattoi vähentyä suhteessa katsojien yhteismäärään. Istumapaikkojen lisääminen teki tilasta ahtaamman, ja yhä useampi kärsi tinnituksesta ja huonosta äänentoistosta. Istumapaikkojen lisäämisellä olisi voinut olla positiivinen vaikutus, jos myös äänenvoimakkuutta olisi nostettu ja katsomoa laajennettu. Tilanne on täysin kuviteltu, eikä vertailtujen muuttujien oikea vaikutus ole välttämättä sama kuin kuvailtu. Periaate on kuitenkin sama.

Näkyykö harhoja?

Kyseessä on muuttujien vuorovaikutuksen aiheuttama harha. Tämä harha on yksimuuttujatestin heikkous, koska yksimuuttujatestillä tutkittu optimi parametriarvo on optimi vain kyseisen testin järjestelyssä. Se tarkoittaa, että optimiksi todettu parametriarvo ei ole enää optimi, jos jonkin muun parametrin arvo muuttuu. Optimoitaessa useampi parametri tekemällä monta yksimuuttujatestiä peräkkäin järjestely muuttuu aina, kun testissä selviää aikaisempaa optimaalisempi parametriarvo. Yksimuuttujatestit ovat myös alttiimpia tuntemattomille tekijöille. Nimensä mukaisesti yksimuuttujatesteillä optimoidaan vain yhtä muuttujaa kerrallaan, jolloin testin tuntemattomia tekijöitä ja vakioita on hankalampi pitää vakiona järjestelyiden välillä, koska testi täytyy toistaa erikseen jokaiselle parametrille. (Cuthbert 1973, 353.)

Harha saadaan eliminoitua optimoimalla parametrit tilastollisella koesuunnitelmalla. Koesuunnitelmajärjestelyissä jokainen parametri voidaan optimoida samassa testissä useassa erilaisessa järjestelyssä, jolloin parametrien vuorovaikutus otetaan huomioon. Kaikki parametrit voidaan testata samalla testillä, ja testattujen arvojen väliarvot otetaan myös huomioon. Osa virhelähteistä saadaan vakioitua, koska todennäköisesti useamman tuntemattoman tekijän vaikutus on saman suuruinen saman testin jokaisessa järjestelyssä. (Czitrom 1999, 126–127.)

Yksimuuttujatesteillä on oma paikkansa

Heikkouksista huolimatta yksimuuttujatesteillä on oma paikkansa. Tapauksissa, joissa koesuunnitelman suunnittelu ja järjestely vaatisi huomattavasti enemmän vaivaa ja muuttujia on vain yksi tai muuttujien välillä ei ole todettu vuorovaikutuksia.

Opinnäytetyössä optimointiin valittiin yksimuuttujatesti, koska uutena asiana koesuunnitelmaan perehtyminen ja sen toteutus olisi vaatinut merkittävän paljon aikaa ja resursseja. Nyt on kuitenkin selvää, että muuttujien määrän ja vuorovaikutusten takia proteiinituotannon optimointi on järkevää suorittaa koesuunnitelmalla. (Friedman & Savage 1947, 2–5.)

Lähteet

Cuthbert, D. 1973. One-at-a-Time Plans. Journal of the American Statistical Association. 1973. Vol. 68, No. 342, 353–360. Viitattu 27.04.2024. https://www.jstor.org/stable/2284076.

Czitrom, V. 1999. One-Factor-at-a-Time Versus Designed Experiments. The American Statistician. 1999. Vol. 53, No. 2, 126–131. Viitattu 27.04.2024. https://polaris.imag.fr/arnaud.legrand/teaching/2011/EP_czitrom.pdf.

Friedman, M. & Savage, L. 1947. Planning Experiments Seeking Maxima. Selected Techniques of Statistical Analysis for Scientific and Industrial Research, and Production and Management Engineering. 1947. 363–372. Viitattu 27.04.2024. https://miltonfriedman.hoover.org/internal/media/dispatcher/214332/full.

Kuvat ovat kirjoittajan omia.